作者：俞乔，高佳希，何晓松， 周晓明，戴美红，俞军
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
【摘要】 目的 探讨多西紫杉醇(docetaxcel)诱导体外培养人乳腺癌MCF7细胞凋亡的作用及凋亡的分子机制。方法 通过MTT比色法分析多西紫杉醇对人乳腺癌MCF7细胞增殖的影响；应用光镜、电镜观察细胞形态学的改变；AnnexinV/PI双染流式细胞术检测肿瘤细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响；免疫组化方法检测凋亡相关基因bax、bc12的表达变化。结果 多西紫杉醇可明显抑制人乳腺癌MCF7细胞的增殖，并可导致其形态学的改变；随着加药时间的增长，G2/M期细胞增多，G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系；加药（IC50）48h后早期凋亡细胞明显增多，同时可上调bax和下调bc12的蛋白表达量。结论 多西紫杉醇可明显抑制MCF7肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡。其分子机制可能与激活bax和抑制bc12等凋亡调控基因有关。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
【关键词】 多西紫杉醇；人乳腺癌MCF7细胞；细胞凋亡；bax；bc12
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
Key words：Docetaxcel; MCF7; Apoptosis; bax; bc12
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
多西紫杉醇(docetaxcel)为有丝分裂抑制剂,该药还有促进细胞凋亡的作用。目前临床上多西紫杉醇作为化疗药物已开始用于乳腺癌、肺癌、胃癌和食管癌等的治疗[1, 2],具有较好效果,且副作用较少。本研究旨在探讨多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF7肿瘤细胞的生长及凋亡作用，以揭示多西紫杉醇的抗癌疗效及作用机制。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1 材料和方法
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.1 药物 多西紫杉醇，购自英国罗纳普朗克乐安公司，含量为20mg/支，0.9%无菌生理盐水配成所需浓度。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.2 细胞株 人乳腺癌细胞MCF7由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%的小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的1640培养基 (美国GIBCO公司),37℃，5% CO2 培养箱中培养传代。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3 实验方法
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3.1 多西紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF7的增殖作用研究（四甲基偶氮唑盐MTT比色法） 取对数生长期细胞用0.02% EDTA消化制成2×104/100μl细胞悬液。接种于96孔板，100μl/孔，置37℃，5％ CO2培养箱孵育过夜。给予相应浓度多西紫杉醇，对照组加入相同体积的培养基。ELx800通用型酶标仪（美国BioTek公司）570nm处检测OD值。抑制率计算如下：
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
抑制率%=1-加药组细胞平均吸光值对照组细胞平均吸光值×100%
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3.2 多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响 细胞经0.02% EDTA消化后，制成细胞悬液1×106/ml，贴壁后加多西紫杉醇1.2μM，作用48h后，光镜下观察（×40）。收集细胞，电镜观测。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3.3 多西紫杉醇对MCF7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响 将处于对数生长期的细胞， 调成1×106/ml， 待细胞贴壁后， 加入多西紫杉醇1.2μM， 对照组不加药， 分别于24h、 48h、 72h收集细胞， 用碘化丙啶（PI）进行DNA染色， 用流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）进行DNA含量分析和细胞周期分析， 分析软件为MODFIT和CELLQUEST。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3.4 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测多西紫杉醇对MCF7的诱导凋亡作用 加药24h、 48h后收集细胞， 依Annexin VFITC Kit（bender公司）操作， 取出195μl细胞悬液加入5μl Annexin VFITC混匀并且室温放置10min。 用PBS清洗细胞并重新悬浮于190μl以配好的结合缓冲液中。 加10μl的20μg/ml的PI， 流式细胞仪检测早期细胞凋亡情况。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
1.3.5 免疫组化检测多西紫杉醇对MCF7细胞bax、 bc12基因蛋白表达的影响 将1×106细胞接种于25ml细胞培养瓶中， 待细胞完全贴壁后,加多西紫杉醇1.2μM， 作用48h后， 收集细胞， 涂片， 4℃纯丙酮固定， 然后分别加入抗bax、bc12抗体， 室温下孵育60min或4℃过夜； 生物素标记的二抗， 37℃孵育60min， DBA溶液显色后， 苏木素复染， 中性树胶封固， 镜检。 阳性判断： bax、bc12基因产物以胞浆和/或胞膜着咖啡色为阳性细胞。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2 结果
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2.1 多西紫杉醇对MCF7细胞生长的抑制作用 采用MTT法，研究多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用，绘制其生长抑制曲线，经线性回归得到，药物作用48h，多西紫杉醇对MCF7细胞的IC50为1.20±0.20μM，表明多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF7有生长抑制作用，并呈现明显的量效关系，见图1。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2.2 多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响 光镜研究结果表明，人乳腺癌细胞MCF7经多西紫杉醇作用48h后，给药组出现明显改变，癌细胞变圆，坏死，生长缓慢。对照组细胞呈上皮性生长迅速，细胞轮廓清楚，见图2。电镜下观察到,对
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
图1 多西紫杉醇对MCF7细胞的抑制作用
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
照组：细胞核大,形状不规则,常染色,质丰富,核仁大而明显,见多个核仁。药物作用后,癌细胞核固缩，异染色质增多，核碎裂，胞质中出现大小不一的空泡,裂隙细胞表面微毛消失或变粗，见图3。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2.3 多西紫杉醇对MCF7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响 实验结果表明MCF7细胞经多西紫杉醇1.2μM作用24h、48h、72h后，其凋亡率分别为36.06%、72.25%、76.15%，并呈时间依赖性。对照组分别为20.25%、16.54%、25.61%。细胞周期测定显示多西紫杉醇可使MCF7细胞G2/M期细胞增多，G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系，见表1。表1 多西紫杉醇（1.2μM）对MCF7细胞周期的影响
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2.4 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测结果 用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测可区别活细胞、死亡细胞和早期凋亡细胞，正常细胞FITC及PI拒染(A-/P- ),在流式细胞分析图上为LL区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI拒染(A+/P- ),图上显示为LR区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(A+/P+),图上显示为UR区细胞簇。结果表明，多西紫杉醇作用后，细胞的早期凋亡率为7.83%(24 h), 11.95%(48 h)，21.81%(72 h)，见图4。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
A:未加药组细胞，LL:85.28%，UR:5.97%, LR:5.28%; B: 加阳性对照药5Fu组细胞（2.5μM)，LL:57.50%，UR:3.54%, LR:38.85%; C：加多西紫杉醇组细胞（1.2μM)，LL:65.08%，UR:6.74%, LR:25%
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
图4 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测早期凋亡率结果
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
2.5 多西紫杉醇对MCF7细胞bax、bc12基因蛋白表达的影响 经多西紫杉醇作用后， bc12基因表达蛋白细胞浆和/或胞膜未见着咖啡色，而未加药组可见大部分细胞浆和/或胞膜着咖啡色。经多西紫杉醇作用后，bax基因表达蛋白大部分细胞浆和/或胞膜着咖啡色，而未加药组可见大部分细胞浆和/或胞膜未着咖啡色，见图5。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
3 讨论
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
多西紫杉醇具有广泛的抗瘤作用,可治疗多种晚期癌症,如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌和食管癌等。近年来许多研究证明,多西紫杉醇可诱导多种肿瘤细胞凋亡[1, 2]。正是由于这种诱导多种细胞凋亡的能力,使多西紫杉醇具有特殊的临床疗效。我们利用乳腺癌细胞株MCF7为材料,研究多西紫杉醇对细胞凋亡的诱导作用和对乳腺癌细胞周期的影响,并探讨多西紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡的机制。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
本研究发现其对体外培养人乳腺癌细胞MCF7有明显的抑制作用， 其IC50 为1.2μM； 多西紫杉醇作用后的MCF7细胞超微结构与对照组相比有明显变化， 细胞核固缩， 核碎裂， 细胞变圆坏死， 有力的证明多西紫杉醇对MCF7细胞的杀伤作用。 流式细胞术结果显示细胞凋亡率随时间增加明显提高， 呈时间依赖性。 细胞周期变化显示多西紫杉醇可使得G2/M期细胞增多， G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系， 有丝分裂受阻， 导致凋亡。AnnexinV/PI双染流式细胞术结果显示细胞早期凋亡率增加。 免疫组化结果表明多西紫杉醇可抑制bc12并且增加bax的蛋白表达量。 以上结果表明多西紫杉醇能够抑制肿瘤细胞的生长， 此作用是通过诱导细胞凋亡引起的。 凋亡的分子机制可能是抑制bc12及激活bax的表达。 bax和bc12都属于bc12家族， bc12编码蛋白抑制凋亡， bax编码蛋白促进凋亡， 有文献报道[5, 6]， bc12/bax比例可能是决定细胞对凋亡刺激信号的敏感性的重要[本文由点滴论文网整理www.ddlw.net]因素之一。 当bc12过量时， 细胞免遭凋亡， 反之， 细胞易于凋亡。 bax可能诱导细胞色素C的释放， bc12与bax拮抗抑制细胞色素C释放， 阻止其对Caspase蛋白酶的激活， 抑制细胞凋亡。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
多西紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物,作用是诱导凋亡。我们对多西紫杉醇处理的乳腺癌细胞MCF7进行了检测,发现其典型的凋亡特征:电镜观察到细胞核体积缩小,染色质浓缩致密,并沿核膜分布形成新月体状,细胞膜微绒毛消失,细胞浆内线粒体缩小,凋亡小体形成；低Ｇ1峰出现,凋亡的诱导有时间和浓度的依存性。AnnexinV/PI双染流式细胞术结果显示细胞早期凋亡率增加；同时检测的凋亡相关蛋白bc12与bax也证明多西紫杉醇可以诱导MCF7细胞凋亡，除此之外，多西紫杉醇是否还作用于其他基因诱导肿瘤细胞凋亡，如何作用，又是通过何种机制使细胞阻滞于G2/M期，有丝分裂受阻，我们正在做进一步探讨。
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
【参考文献】
［1］ Ballestrero A, Montemurro F, Gonella R, et al. Dosedense vinorelbine and paclitaxel with granulocyte colonystimulating factor in metastatic breast cancer patients: antitumor activity and peripheral blood progenitor cell mobilization capability[J]. Breast Cancer Res Treat，2003，82(3)：185190.
Tiersten AD, Nelsen C, Talbot SL， et al. A phase II trial of docetaxel and estramustine in patients with refractory metastatic breast carcinoma[J]. Cancer，2003， 97(3)：537544.
Heerdt BG, Houston MA, Wilson AJ, et al. The intrinsic mitochondrial membrane potential (Deltapsim) is associated with steadystate mitochondrial activity and the extent to which colonic epithelial cells undergo butyratemediated growth arrest and apoptosis[J]. Cancer Res，2004， 63(19)： 63116319.
Werner AB, E de Vries, SW Tait, et al. Bcl2 family member Bfl1/A1 sequesters truncated bid to inhibit is collaboration with proapoptotic Bak or Bax[J]. J Biol Chem，2002， 277(25)：2278122788.
Gupta S, Afaq F, Mukhtar H. Involvement of nuclear factorkappa B, Bax and Bcl2 in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells[J]. Oncogene，2002， 21(23)：37273738.
[6] Hou Q, Cymbalyuk E, Hsu SC, et al. Apoptosis modulatory activities of transiently expressed Bcl2: roles in cytochrome C release and Bax regulation[J]. Apoptosis，2003，8(6)，617629.
本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！
