尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCLH446增殖的抑制作用-点滴论文网为您提供专业论文参考资料。

作者：刘英杰，马远方，刘广超，吴雄文

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

【摘要】 目的研究尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCLH446增殖的抑制作用,为临床治疗提供实验室依据。方法常规培养人小细胞肺癌细胞株NCLH446，MTT法检测尼美舒利的细胞毒性作用；倒置显微镜与Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学变化；流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率。结果 MTT显示尼美舒利呈剂量与时间依赖性抑制人小细胞肺癌细胞株NCLH446的增殖；倒置显微镜下可见细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中。荧光显微镜下可见细胞核染色质致密浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎，凋亡小体形成等。FCM检测结果表明尼美舒利既可诱导NCLH446细胞凋亡，又可引起坏死，400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后，细胞早期凋亡率为7.65%，晚期凋亡率为29.76%，细胞坏死占23.9%。结论尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCLH446有较显著的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡与坏死有关。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

【关键词】 人小细胞肺癌细胞株NCLH446；尼美舒利；细胞凋亡

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

Inhibitory Effects of Nimesulide on Proliferation of Human Small Cell Lung Cancer Cell Line NCLH446

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

Key words：Human small cell lung cancer; Cell line NCLH446； Nimesulide； Apoptosis

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

近年来,选择性环氧化酶2 抑制剂的抗肿瘤作用日益引起重视，尼美舒利（Nimesulide）是一种人工合成的环氧化酶2特异性抑制剂, 其对人小细胞肺癌细胞株NCLH446有无抑制作用国内外文献未见报道，本研究旨在通过MTT、倒置显微镜与荧光显微镜,流式细胞仪等实验方法观察尼美舒利体外对人NCLH446细胞株的抑制作用,为临床小细胞肺癌的治疗提供实验室依据。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1 材料与方法

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1.1 材料人小细胞肺癌细胞株NCLH446购自中国科学院细胞库，尼美舒利购自Cayman公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清为TBD公司产品；MTT为sigma公司产品。FITCAnnexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒为BD公司产品。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1.2 方法

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1.2.1 MTT法细胞毒性分析

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

将对数生长期NCLH446细胞制备成5×104/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μl, 于37℃,5% CO2的培养箱中培养，24h后换为含有不同浓度尼美舒利(0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、 25、 50、 100、 200、 400、800μmol/ L)的培养液，对照组以正常培养液替代尼美舒利,每孔200μl，分别培养24、36、48、60、72h, 更换不含药物的培养液200μl/孔，并加入0.5% MTT 20μl/孔，继续培养4h，弃上清，每孔加入150μl DMSO,振荡10min，全自动酶标仪(Thermo Multiskan Ascent)测OD570吸收值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次。细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1.2.2 细胞凋亡形态学观察

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

在6孔板中放入盖玻片，加入含NCLH446细胞的164010培养液，细胞密度为3×105/ml，2ml/孔，置37℃，5% CO2培养24h，弃去培养液，加入含400μmol/L尼美舒利的164010培养液2ml/孔，对照孔仍用正常培养液。置37℃、5% CO2培养24h。倒置显微镜下观察细胞形态变化，将盖玻片取出，用PBS洗后，丙酮固定5min，再用PBS洗，Hoechst 33258染色10min，水洗，甘油封片，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

1.2.3 流式细胞仪检测NCLH446细胞凋亡率

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

收集并制备NCLH446细胞悬液，加入24孔培养板，1ml/孔，细胞密度为105/孔，置37℃，5% CO2培养24h，把培养液换为含400μmol/ L尼美舒利的164010，空白孔及对照孔仍用正常培养液，置37℃，5% CO2温箱培养24h，收集细胞于小离心管中离心，用标记液洗一次，每孔细胞悬浮于100μl标记液中，加FITCAnnexin Ⅴ溶液及PI染液各5μl，混匀后避光室温放置15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Cellquest软件分析。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

2 结果

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

2.1 MTT法尼美舒利对NCLH446细胞的毒性作用

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

MTT结果显示尼美舒利对NCLH446细胞的体外增殖有较强的抑制作用，且存在时间和剂量依赖性。当尼美舒利浓度在25μmol/L以下时，其对NCLH446细胞的抑制作用不明显，见图1、2。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

2.2 细胞凋亡形态学观察

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

倒置显微镜下观察：在正常培养情况下NCLH446细胞生长良好, 形态为多角形透明、折光性好、细胞铺展良好；经尼美舒利处理后,细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中，并随尼美舒利作用时间的延长其飘浮细胞也增多。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

凋亡细胞荧光染色：400μmol/L尼美舒利作用24h后的NCLH446细胞染色质浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎等细胞凋亡形态特征明显。而阴性对照细胞染色质疏松均匀，核着色均一，荧光相对弱，细胞核大小一致，见图3。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

2.3 流式细胞仪检测NCLH446细胞凋亡率

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

Annexin Ⅴ/PI双染，流式细胞仪检测结果表明尼美舒利既可诱导NCLH446细胞凋亡，又可造成其坏死，400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后，细胞早期凋亡率为7.65%，晚期凋亡率为29.79%，细胞坏死占23.9%，见图4。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

3 讨论

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

环氧化酶(cyclooxygenase,COX) 是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素(PG) 过程中重要[本文由点滴论文网整理www.ddlw.net]的限速酶,催化产生的PG参与机体的多种生理及病理过程,如炎症、发热、出凝血机制等。目前认为COX有COX1 和COX2两种类型,后者为可诱生型COX,静止细胞中不易被测到，在一些刺激物刺激后,可以检测到COX2表达增加。近年来研究表明,COX2除了在炎症中发挥重要[本文由点滴论文网整理www.ddlw.net]作用外,还与多种肿瘤的发生、发展和转移有关。COX2可通过以下机制参与肿瘤的发生发展[19]。①刺激细胞生长；②抑制细胞凋亡，其机制还不完全清楚,但至少有以下3 条途径:增加bcl2表达、减弱一氧化氮(NO) 信号途径和降低细胞间神经鞘氨醇含量；③刺激新生血管形成；④增强肿瘤的侵袭和转移能力；⑤免疫抑制等。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

由于COX2与肿瘤的关系比较密切。COX2抑制剂在肿瘤防治中的应用逐渐受到重视，尼美舒利是一种选择性COX2抑制剂，为磺酰胺类消炎镇痛药,能抑制炎症组织内前列腺素的合成,而不抑制胃黏膜内前列腺素的合成,因而能缓解炎症症状,对胃及十二指肠等的不良反应则较轻。本研究结果提示尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCLH446有较显著的抑制作用, 且呈剂量与时间依赖性，该作用与其能诱导NCLH446细胞凋亡与坏死有关。其诱导细胞凋亡与坏死的机制除了与抑制COX2的表达有关外是否与其他机制有关有待进一步研究。

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转载！

【参考文献】
［1］ Dannenberg AJ, Altorki NK,Boyle JO, et al. Cyclooxygenase 2:a pharmacological target for the prevention of cancer[J]. Lancet Oncol,2001,2(9): 544551.

Howe LR,Dannenberg AJ. A role for cyclooxygenase 22 inhibitors in the prevention and treatment of cancer[J]. Semin Oncol,2002, 29 (3Suppl11): 111119.

Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. COX2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors[J]. Cancer, 2000, 89 (12): 26372645.

Cao Y, Prescott SM. Many actions of cyclooxygenase2 in cellular dynamics and in cancer[J]. J Cell Physiol, 2002, 190 (3): 279286.

Tsujii M, Kawano S,Tsuji S, et al. Cyclooxygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[J]. Cell, 1998,93(5): 705716.

[6] Masferrer JL, Leahy KM, Koki AT, et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase22 inhibitors[J]. Cancer Res, 2000, 60(5): 13061311.

[7] Bailey T, Biddlestone L, Shepherd N, et al. Altered cahern and catenin complexes in the Barrett's esophagusdysplasiaadenocarcinoma sequence with disease progression and dedifferentiation[J]. Am J Pathol, 1998, 152（1）:135144.

[8] Lin MT, Lee RC, Yang PC， et al. Cyclooxygenase2 inducing Mcl1dependent survival mechanism in human lung adenocarcinoma CL 1.0 cells[J]. Biol chem, 2001,276(52):4899749002．

[9] Shono T,Tofilon PJ, Braner JM,et al. Cyclooxygenase2 expression in human gliomas: prognostic significance and molecular correlations[J].Cancer Res,2001,61(11):43754381．

本文由“点滴论文www.ddlw.net网”提供,禁止转